Osvita.ua Вища освіта Реферати Біологія Копіювання ДНК або полімеразна ланцюгова реакція. Реферат
Провідні компанії та навчальні заклади Пропозиції здобуття освіти від провідних навчальних закладів України та закордону. Тільки найкращі вищі навчальні заклади, компанії, освітні курси, школи, агенції. З питань розміщення інформації звертайтесь за телефоном (044) 200-28-38.

Копіювання ДНК або полімеразна ланцюгова реакція. Реферат

Полімеразна ланцюгова реакція. Ампліфікація РНК. Аналіз ПЛР-ампліфікованої ДНК. Підготовка ПЛР-продуктів. Гель-електрофорез

Уперше склад інгредієнтів, що входять у реакційну суміш для постановки полімеразної ланцюгової реакції, і основні принципи використання праймерів (коротких штучно синтезованих молекул ДНК) для одержання копій ДНК були описані Kleppe із співавт. у 1971 році. Однак тоді ще не була продемонстрована основна риса ПЛР - експонентне збільшення кількості копій фрагмента вихідної ДНК як результат реакції.

Це було здійснено в 1985 р. на фірмі Cetus. Наступне використання в ПЛР термостабільної ДНК-полімерази  істотно розширило можливості її застосування, як у наукових цілях, так і в клініці.

У 1985 році Saiki із співавт. опублікували статті, у якій була описана ампліфікація геномної послідовності b-глобіна. З цього моменту кількість публікацій, у яких автори повідомляли про застосування ПЛР у своїх роботах, стало збільшуватися в геометричній прогресії. Метод став настільки популярний, що сьогодні уже важко представити роботу в області молекулярної біології без його використання.

Особливо бурхливий розвиток метод полімеразної ланцюгової реакції одержав завдяки міжнародній програмі "Геном людини". Були створені сучасні лазерні технології секвенування (розшифровки нуклеотидних послідовностей ДНК). Якщо в недавнім минулому для розшифровки послідовності ДНК розміром у 250 пару нуклеотидів (п. н.) був потрібна тиждень, то сучасні лазерні секвенатори дозволяють визначати до 5000 п. н. у день. Це у свою чергу сприяє значному росту інформаційних баз даних, що містять послідовності ДНК.

В даний час запропоновані всілякі модифікації ПЛР, показана можливість створення тест-систем для виявлення мікроорганізмів, виявлення крапкових мутацій, описані десятки різних застосувань методу. Ми коротенько розглянемо теоретичні основи ПЛР і застосування цього методу для молекулярно-генетичного дослідження зразків тканин. Основна увага буде приділено практичним аспектам, важливим для аналізу звичайних тканинних зразків.

Полімеразна ланцюгова реакція

ПЛР - це здійснювана in vitro специфічна ампліфікація нуклеїнових кислот, ініційована синтетичними оліго-нуклеотидними праймерами; основні її етапи представлені на мал. 2. ПЛР-цикл складається з теплової денатурації ДНК, її отжога з праймером і подовження ланцюга (елонгації); зміна цих етапів відбувається в результаті простої зміни температури.

Праймери при цьому орієнтуються на матриці так, що число раундів реплікації росте експоненціально, відповідно збільшується і число копій специфічної нуклеотидної послідовності.

Застосування молекулярних методів для цілей клінічної діагностики обмежується їхньою невисокою чутливістю і тривалістю аналізу. Так, для виявлення нуклеїнової кислоти-мішені методом гібридизації in situ із застосуванням радіоактивно  міченого зонда необхідно, щоб мішень була присутня в препараті в декількох тисячах копій. Нерідке число аномальних послідовностей у клінічному препараті діагностично-значимо, але менше цієї величини і гібридизація може дати помилко негативний результат.

На відміну від цього ПЛР дозволяє виявити унікальну нуклеотидну послідовність. Для цього в реакційну суміш додають у великому надлишку специфічні для даної послідовності олігонуклеотидні праймери ("амплімери"), що утворюють з нею комплекс, і проводять реплікацію ДНК in vitro. Оскільки амплімери гібридизуються з обома ланцюгами ДНК, то і нативна послідовність, і синтезовані ПЛР-продукти можуть служити матрицями в наступних раундах реплікації, у результаті чого число копій унікальної послідовності експоненціально збільшується.

Завдяки цьому послідовності, що є присутнім у клінічному препараті в мінімальній кількості (одна чи кілька копій) і не піддаються виявленню ніякими іншими методами, легко виявляються за допомогою ПЛР. ПЛР дозволяє знайти всього одну аномальну послідовність на 100000-1000000 нормальних кліток.

Експонентне збільшення числа копій молекули-мішені не тільки забезпечує високу чутливість методу, але і полегшує їхнє виявлення. Кожен раунд ПЛР займає від 2 до 5 хв., і звичайно для досягнення необхідної чутливості досить 25-50 раундів, тобто 2-4 год. Таким чином, весь аналіз можна провести протягом одного дня. Крім того, оскільки зміст ПЛР-продуктів досить великий, можна використовувати неізотопні методи детекції.

У табл. 1 приведені дані, що дозволяють порівняти метод ПЛР з іншими молекулярно-генетичними методами дослідження. Видно, що він володіє двома важливими перевагами: високою чутливістю і нетривалістю аналізу.

Таблиця 1. Порівняння різних методів гібридизації

 

ПЛР

Блот-гібридизація по Саузерну

Гібридизація in situ

Чутливість

1/100000

1/100

10 мішеней

Специфічність

Висока

Висока

Висока

Тривалість аналізу

1 доба

1 доба

1 доба

 

Ампліфікація РНК

Можливість використання РНК як мішень для ПЛР істотно розширює спектр застосування цього методу. Наприклад, геноми багатьох вірусів (гепатит З, вірус інфлюенци, пікорнавіруси і т. д.) представлені саме РНК. При цьому в їхніх життєвих циклах відсутня проміжна фаза перетворення в ДНК. Для детекції РНК необхідно в першу чергу перевести її у форму ДНК.

Для цього використовують обернену транскриптазу, що виділяють із двох різних вірусів: avian myeloblastosis virus і Moloney murine leukemia virus. Використання цих ферментів зв'язано з деякими труднощами. Насамперед, вони термолабільні і тому можуть бути використані при температурі не вище 42°С, тому що при такій температурі молекули РНК легко утворять вторинні структури, то ефективність реакції помітно знижується і за різними оцінками приблизно дорівнює 5%.

Починаються спроби обійти цей недолік використовуючи в якості оберненої транскриптази термостабільну полімеразу, отриману з термофільного мікроорганізму Thermus Thermophilus, що виявляє транскриптазну активність у присутності Mn2+. Це єдиний відомий фермент, здатний виявляти як полімеразну, так і транскриптазну активність.

Для проведення реакції оберненої транскрипції в реакційній суміші також як і в ПЛР повинні бути присутнім праймери як запал і суміш 4-х дНТФ, як будівельний матеріал.

Після проведення реакції оберненої транскрипції, отримані молекули кДНК можуть служити мішенню для проведення ПЛР.

Аналіз ПЛР-ампліфікованої ДНК

Для аналізу ПЛР-ампліфікованої ДНК використовують різні методи. Ми розглянемо три найбільш простих: гель-електрофорез, дот-блот-гібридизацію і блот-гібридизацію по Саузерну. З їхньою допомогою можна аналізувати більшість ПЛР-продуктів, але абсолютно точні результати можна одержати тільки секвенуванням.

Підготовка ПЛР-продуктів

Насамперед необхідно видалити мінеральну олію, що покривала реакційну суміш. Для цього в пробірку для ПЛР додають краплю хлороформу, пробірку струшують і центрифугують при 12 000 g протягом 1 хв, щоб відокремити водяну фазу, що містить ПЛР-продукти. Ампліфіковану; ДНК можна зберігати з хлороформом при 4°С протягом декількох тижнів. Для наступного аналізу звичайно беруть від 1/10 до 1/5 обсягу реакційної суміші.

При використанні ДНК виділення з кліток крові підготовчі роботи не проводяться.

Гель-електрофорез

Електрофорез в агарозном гелі дозволяє легко, без застосування радіоізотопів, знайти ампліфіковану ДНК і визначити її розмір. Зупинимося на деяких її особливостях стосовно аналізу ПЛР-ампліфікованої ДНК. 10-20 мкл ампліфікованої ДНК розділяють у 2% агарозном гелі з додаванням спеціального барвника ДНК, наприклад, бромистого етидія разом зі стандартними фрагментами розміром 50-1000 п. н.

При заливанні за допомогою гребінок у гелі формують спеціальні лунки, у які надалі вносять продукти ампліфікації. При використанні ДНК виділеної з клітин крові використовують 5 мкл ампліфікованої ДНК змішують з 3 мкл барвники на парафилме і наносять у лунку.

Пластину гелю поміщають в апарат для горизонтального гель-електрофорезу і підключають джерело постійної напруги. Негативно заряджена ДНК починає рухатися в гелі від мінуса до плюса. При цьому більш короткі молекули ДНК рухаються швидше, ніж довгі. На швидкість руху ДНК у гелі впливає концентрація агарози, напруженість електричного поля, температура, склад електрофорезного буфера і, у меншому ступені, ГЦ-склад ДНК.

Усі молекули одного розміру рухаються з однаковою швидкістю. Барвник вбудовується (інтеркалірує) площинними групами в молекули ДНК. Після закінчення електрофорезу, що продовжується від 10 хв. до 1 години, гель поміщають на фільтр трансіллюмінатора, що випромінює світло в ультрафіолетовому діапазоні (254 - 310 нм). Енергія ультрафіолету, що поглинається ДНК в області 260 нм, передається на барвник, змушуючи його флуоресценувати в оранжево-червоній області видимого спектра (590 нм).

Яскравість смуг продуктів ампліфікації може бути різною. Тому часто в ПЛР-лабораторіях прийнято оцінювати результат по трьох- чотирьох чи п'ятибальній системі. Однак, як уже відзначалося раніше, це не можна зв'язувати з початковою кількістю Днк-мішені в зразку. Часте зменшення яскравості світіння смуг зв'язано зі зниженням ефективності ампліфікації під впливом інгібіторів або інших факторів.

Електрофорез проводять при високій напрузі (10-15 В/див), оскільки утворювані при ПЛР невеликі фрагменти складно детектувати після електрофорезу протягом ночі при невеликій напрузі внаслідок їхньої інтенсивної дифузії. Розділення можна підвищити, використовуючи поліакриламідні або агарозні гелі NuSieve (FMC Bio-Products, Rockland, USA) з високою концентрацією агарози (3-4%). Утім, якщо аналіз потрібно провести швидко і при невеликих витратах, цілком прийнятні 2% агарозні гелі.

Звичайно при ампліфікації ДНК, виділеної з фіксованих тканин, вихід ПЛР-продуктів нижчий і вони менш специфічні, чим у випадку ампліфікації високо-очищеної ДНК.

Інструкція 1 по приготуванню агарозного гелю (50мол).

Агарозний гель складається з 1,8% агарози і 98,2% Трис-буфера.

Зважуємо агарозу (0, 9г).

Переносимо агарозу в термостійку колбу.

Додаємо  50мол трис-буфера в колбу.

Установлюємо плашку, установлюємо гребінку на плашку.

Плавимо агорозу шляхом нагрівання в мікрохвильовій печі до одержання однорідного розчину.

Додаємо барвник етидіум бромід у колбу і перемішуємо.

Заливаємо агарозний гель  на плашку.

Гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК по Саузерну

Цей метод дозволяє ідентифікувати смуги в гелі, що спостерігаються після електрофорезу ампліфікованої ДНК. Для гібридизації використовуються як ізотопно, так і неізотопно мічені зонди. Докладно метод гібридизації ПЛР-продуктів описаний у протоколі 1.

Протокол 1. Гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК по Саузерну

Матеріали:

  • Буфер для денатурації: 1,5 М NaOH, 0,5 М NaCl
  • Буфер для нейтралізації: 1,5 М трис-Нс1, 0,5 М NaCl, p 6,5
  • 20 х SSPE: 3,6 М NaCl, 0,2 М фосфат натрію, 0,02 М ЄДТА, рН 7,4
  • 10% (в/о) ДСН

Методика:

  • Для денатурації фрагментів ДНК гель вимочують у буфері для денатурації при обережному погойдуванні протягом 30 хв. при кімнатній температурі, потім витримують у буфері для нейтралізації протягом 30 хв.
  • За цей час вимочують нейлоновий фільтр для переносу ДНК у 6 х SSPE протягом 5хв. (або довше). Ми використовуємо фільтри Genetrans 45 (Fiasco, Wolburn, Massachusetts, USA).
  • Збирають систему для переносу ДНК, і проводять перенос при кімнатній температурі протягом ночі. Як буфер для переносу використовують 20 х SSPE.
  • По закінченні переносу знімають фільтрувальний папір і відзначають положення лунок на фільтрі. Фільтр знімають і для видалення прилиплої агарози промивають у 20 х SSPE протягом 1 хв.
  • Пришивають ДНК до фільтра, помістивши останній (стороною з ДНК нагору) на 5 хв. під УФ-лампу (254 нм). Можна скористатися і спеціальним приладом для пришивання ДНК (Stratagene, La Jolla, California, USA).
  • Поміщають фільтр у поліетиленовий пакет і запаюють його. Проводять перед-гібридизацію при 42 0С протягом 10 хв. і гібридизацію з відповідним міченим зондом при тій же температурі протягом 30-60 хв. Як зонд звичайно використовують 5-мічені за допомогою полінуклеотидкінази олігонуклеотиди.
  • Промивають фільтр у двох-трьох змінах 2 х SSPE, 0,1% ДСН, по 5 хв. у кожній зміні. Іноді на цьому етапі проводять відмивання й у більш жорстких умовах, але необхідність цієї процедури визначають експериментальним шляхом.
  • Гібридизований зонд виявляють за допомогою радіоавтографії або неізотопними методами детекції.

Дот-блот-гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК

Дот-блот-гібридизація дає просту відповідь по типу так-ні й особливо корисна в тих випадках, коли проводиться аналіз великого числа зразків. Один із прикладів застосування цього методу описаний у протоколі 2.

Протокол 2. Дот-блот-гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК

Матеріали:

  • Розчин для денатурації: 0,4 М NaOH, 1 мм ЭДТА.
  • 20 х SSPE (див. протокол 15.7).
  • Нейлоновий фільтр.
  • Прилад для одержання дот-блотів.

Методика:

  • Вимочують нейлоновий фільтр у дистильованій воді не менш 5 хв.
  • 2.10-20 мкл ПЛР-ампліфікованої ДНК додають до 300 мкл. розчину для денатурації (денатурація при цьому відбувається практично миттєво).
  • Кожен зразок вносять в окремий осередок приладу для одержання дот-блотів; стежать за тим, щоб для усмоктування зразка з осередку було потрібно близько 1 хв.
  • Промивають кожен осередок 20 х SSPE три рази по 5 хв.
  • Виймають фільтр із приладу й обполіскують його в 20 х SSPE.
  • Виконують операції, описані в протоколі 15.7, починаючи з п. 5.

Інтерпретація результатів

Результат ПЛР можна кваліфікувати як позитивний чи негативний у залежності від того, виявлена в зразку інтересуюча нас мішень чи ні. Однак порушення нормального ходу ампліфікації, недостатня чутливість методу і непередбачений поліморфізм послідовності-мішені в області зв'язування праймерів чи гібридизаційного зонда може дати помилково негативний результат.

У випадку забруднення зразків і випадкової гомології між зондом, праймерами і послідовністю, подібною з мішенню, виходять помилково негативні результати. Проблеми, що виникають у зв'язку з перехресними реакціями за участю зонда або праймерів і можливим поліморфізмом.

Вибір контролів

Дуже важливим для правильної інтерпретації результатів є вибір контролів. Позитивні і негативні контролі повинні бути добре охарактеризовані. Часто використовують ДНК із клітинних ліній, що завідомо містять чи не містять послідовність-мішень.

У кожнім аналізі потрібні як мінімум три контролі:

  • позитивний контроль;
  • негативний контроль;
  • бланк-контроль.

Бланк-контроль - це реакційна суміш, у якій присутні усі компоненти, за винятком ДНК; він є індикатором забруднень. Один тип позитивного контролю повинний містити максимальне число послідовностей-мішеней, інший - невелике їхнє число. Це дозволяє визначити чутливість і ефективність ПЛР.

У деяких випадках ампліфікація взагалі не відбувається, і якщо є підстави думати, що отриманий результат помилково негативний, дуже важко визначити, по якій саме причині.

Щоб вирішити цю проблему, кожен зразок необхідно тестувати, провівши ампліфікацію якої-небудь геномної послідовності, наприклад гена рецептора ліпопротеїнів низької щільності або р-глобінового гена. При цьому розмір геномної послідовності-мішені повинний бути небагато більший, ніж досліджуваний; це дозволить переконатися, що ДНК зразка не занадто сильно деградована. При ПЛР будь-якого зразка тканин людини геномна ДНК повинна ампліфікуватися.

Відсутність ампліфікації може означати інгібування ферменту, сильну деградацію ДНК чи те, що її занадто мало. У цьому випадку треба повторити ампліфікацію зразка, збільшивши і зменшивши кількість ДНК-матриці або збільшивши концентрацію ДНК-полімерази Tag. Ампліфікація може  бути відсутня незважаючи на всі прикладені зусилля. Це може бути зв'язане із сильним некрозом досліджуваної тканини або фіксацією препарату не в 10% формаліні, а в інших фіксаторах. У цьому випадку єдиним виходом є повторна біопсія.

Геномні праймери можна використовувати в одному раунді ПЛР разом із праймерами, специфічними у відношенні послідовності-мішені: ампліфікація двох послідовностей йде при цьому одночасно. Такий множинний ПЛР-тест може бути менш чуттєвим, чим той, у якому використовується один набір праймерів, але він виключає появу помилково негативного результату.

Чутливість

Визначити чутливість ПЛР-методу стосовно аналізу фіксованих і залитих у парафін препаратів досить складно. Це зв'язано з відсутністю добре охарактеризованих катаних тканин з відомим змістом послідовності-мішені, а чутливість методу при аналізі очищеної ДНК і ДНК, отриманої з фіксованих формаліном тканин, за таких самих умовах помітно розрізняється.

Однак у даний час існує можливість створювати штучні фіксовані тканини з відомим змістом послідовності-мішені на основі добре охарактеризованих клітинних ліній. Для цього змішують клітки, що містять потрібну послідовність і не містять її, суміш фіксують у формаліні і заливають у парафін.

Отриманий блок нарізають і обробляють так само, як біоптати тканин, проводять ПЛР і визначають чутливість методу. І хоча цей метод не дозволяє визначити чутливість ПЛР-методу з такою високою точністю, як цього хотілося б, він вказує напрямок до правильної інтерпретації результатів.

Суміш кліток Raji (приблизно 50 копій ДНК EBV на клітку) і Molt 3 (не містять EBV) збирали центрифугування, фіксували в 10% забуференному формаліні протягом 1 год. і заливали в парафінові блоки. Робили зрізи товщиною 10 мкм, що містять приблизно по 1000 кліток, обробляли їх, і проводили ПЛР-аналіз з використанням геномних і EBV-специфічних праймерів. Продукти ампліфікації аналізували за допомогою дот-блот-гібридизації з геномним і EBV-специфічним зондами.

Як і треба було очікувати, гібридизація з геномним зондом відбувалася у всіх клітинних сумішах, а з EBV-специфічним спостерігалася тільки в суміші, у якій частка кліток лінії Raji складала 0,01, але не 0,001 або 0,0001. Таким чином, при тих умовах, у яких проводилася ПЛР, вдається виявити приблизно 10 EBV-інфікованих клітин на 1000 нормальних (число клітин, з яким проводився ПЛР-аналіз). Підвищити чутливість можна, змінивши умови проведення ПЛР або використовуючи для аналізу більшу кількість клітин.

Кількісний ПЛР-аналіз

Логічно думати, що кількість утворюваних при ПЛР ДНК корелюється з числом послідовностей-мішеней в аналізованому зразку. Однак так буває не завжди. Часто такі виключення спостерігаються при роботі з препаратами тканин, залитими в парафін: у цьому випадку число факторів, що впливають на ефективність ампліфікації, особливо велике. Це може бути природа тканини, спосіб фіксації і її тривалість, час, що пройшов від моменту одержання тканини до її фіксації, "вік" парафінових блоків, розмір зрізу, кількість виділеної і використаної для ПЛР ДНК.

Часто клінічні зразки отримують в умовах, далеких від оптимальних, що теж утрудняє проведення кількісного аналізу, особливе визначення абсолютної кількості послідовності-мішені. Для таких препаратів розроблений простий відносний метод, заснований на ПЛР-аналізі декількох розведень препарату ДНК. Для цього готують послідовні десятикратні розведенням ДНК у воді і проводять ампліфікацію в умовах, що дозволяють одержати максимальну чутливість; число циклів ПЛР при цьому може досягати 50.

Такий аналіз дозволяє оцінити мінімальне число послідовностей-мішеней у препараті, оскільки при досить сильному розведенні ампліфікація повинна припинитися. Якщо паралельно проводити ампліфікацію якої-небудь геномної послідовності, то можна визначити співвідношення між числом клітин і числом послідовностей-мішенів. При відомому числі клітин у препараті (наприклад, у препараті СМЖ) інтерпретацію результатів проводять так, як це описано в табл. 2.

Таблиця 2. Визначення чутливості методом розведення

Число ампліфікованих кліток

Послідовність-мішень

Геномна послідовність

Інтерпретація

100000

+

+

1 мішень/100000 кліток

10000

+

+

1 мішень/ 10000 кліток

1000

+

+

1 мішень/ 1000 кліток

100

+

+

1 мішень/ 100 кліток

10

+

+

1 мішень/10 кліток

1

+

+

Мішень практично

у кожній клітці

0

-

-

Система працює нормально

 

Точна кількість кліток в останніх розведеннях визначити неможливо внаслідок  помилок у піпетуванні і пуассонівському розподілу числа клітин. Геномні послідовності повинні ампліфікуватися і детектуватися на рівні приблизно 1 клітини. У цьому випадку, якщо послідовність-мішень міститься в 1% клітин, останнє розведення, що дає позитивний сигнал, повинне відповідати 100 клітинам.

В даний час ПЛР-тести можна ставити тільки в спеціально оснащених клінічних лабораторіях. Зразки тканин, одержувані при звичайних хірургічних операціях, фіксують формаліном і заливають у парафін. Такі препарати можна досліджувати методом ПЛР, що при необхідності дозволяє провести молекулярно-генетичний аналіз без заморожування і збереження препаратів.


28.12.2011

Провідні компанії та навчальні заклади Пропозиції здобуття освіти від провідних навчальних закладів України та закордону. Тільки найкращі вищі навчальні заклади, компанії, освітні курси, школи, агенції.

Щоб отримувати всі публікації
від сайту «Osvita.ua»
у Facebook — натисніть «Подобається»

Osvita.ua

Дякую,
не показуйте мені це!